Os espécimes de dentina humana são amplamente empregados em estudos in vitro para avaliar materiais e tratamentos odontológicos, devido à sua relevância biológica e representatividade clínica. Contudo, após o preparo, essas amostras frequentemente necessitam de armazenamento até o momento da análise experimental, e as condições adotadas podem modificar suas propriedades físico-químicas, interferindo na confiabilidade dos resultados. A ausência de consenso na literatura quanto ao meio e ao tempo ideais de preservação justifica a investigação de alternativas de armazenamento que mantenham a estabilidade estrutural da dentina. Assim, o presente estudo avaliou os efeitos de diferentes meios de armazenamento sobre as propriedades físico-químicas de espécimes de dentina. Discos de dentina com 1,8 mm de espessura e 4,2 mm de diâmetro foram obtidos de coroas de dentes humanos hígidos e armazenados em solução salina, timol, saliva artificial, leite esterilizado e meio seco. As análises realizadas incluíram a microdureza Knoop e a razão amida III/fosfato, obtida por espectroscopia de reflectância total atenuada no infravermelho com transformada de Fourier (ATR-FTIR), nos períodos imediatamente após o preparo das amostras e seguindo o armazenamento por 7, 15 e 30 dias. Os resultados indicaram que os espécimes mantidos em solução salina, timol e saliva artificial apresentaram redução da microdureza e aumento da razão amida III/fosfato, evidenciando desmineralização dentinária. Por outro lado, os armazenados em leite esterilizado e meio seco mantiveram estabilidade química e mecânica ao longo do tempo. Conclui-se que o leite esterilizado e o meio seco representam alternativas eficazes para a conservação da dentina em estudos.